Что такое белок s100

Белки s100 представляют собой семейство низкомолекулярных тканеспецифичных кальций-связывающих протеинов модуляторного действия, принимающих участие во многих физиологических процессах организма. Название характеризует способность соединений этой группы полностью растворяться в 100%-ном растворе сульфата аммония при нейтральных значениях pH.

В настоящее время известно 25 представителей этого семейства, которые характерны для разных тканей. Данная особенность говорит о том, что мозгоспецифические белки s100 — это протеины, присутствующие в клетках головного мозга и принимающие участие в нейрофизиологических процессах.

История открытия

Первый s100-протеин был выделен в 1965 году из бычьего мозга учеными Муром и Грегором. В дальнейшем белки этого семейства были найдены у млекопитающих, птиц, рептилий и человека. Изначально считалось, что s100 присутствует только в нервной ткани, но с развитием иммунологических методов протеины данной группы стали обнаруживать и в других органах.

Общая характеристика и топография

Белки семейства s100 присутствуют только у позвоночных животных и у человека. 15 из 25 протеинов этой группы являются мозгоспецифическими, большая часть которых вырабатывается астроглиальными клетками ЦНС, однако некоторая доля присутствует и в нейронах.

Установлено, что 90% всей фракции s100 в организме растворено в цитоплазме клеток, 0,5% локализовано в ядре и 5-7% связано с мембранами. Небольшая часть протеина содержится во внеклеточном пространстве, в том числе в крови и спинномозговой жидкости.

Протеин группы s100 присутствует во многих органах (кожа, печень, сердце, селезенка и др.), но в головном мозге его в сто тысяч раз больше. Самая высокая концентрация наблюдается в мозжечке. Белок s100 также активно вырабатывается в меланоцитах (клетках кожной опухоли). Это стало причиной использования данного соединения в качестве маркера тканей эктодермального происхождения.

Химически белки s100 представляют собой димеры с молекулярной массой 10-12 дальтон. Эти протеины имеют кислую природу, поскольку содержат большое количество (до 30%) остатков глутаминовой и аспарагиновой аминокислот. В состав молекул s100 не входят фосфаты, углеводы и липиды. Эти белки выдерживают нагревание до 60 градусов.

Структура и пространственная конформация

По структуре все представители семейства s100 являются глобулярными белками. В состав одной димерной молекулы входит 2 полипептида (альфа и бета), соединенные друг с другом нековалентными связями.

Большинство представителей семейства являются гомодимерами, образованными двумя одинаковыми субъединицами, но встречаются и гетеродимеры. Каждый полипептид в составе молекулы s100 имеет кальций-связывающий мотив, названный EF-рукой. Он построен по типу спираль-петля-спираль.

Белок s100 содержит 4 α-спиральных сегмента, центральную шарнирную область переменной длины и два концевых вариабельных домена (N и С).

Особенности действия

Сами по себе белки s100 не обладают ферментативной активностью. Их функционирование основано на связывании ионов кальция, которые задействованы во многих межклеточных и внутриклеточных процессах, в том числе сигнального характера. Присоединение Ca 2 + к молекуле s100 приводит к ее пространственной перестройке и открытию целевого протеин-связывающего центра, посредством которого осуществляется взаимодействие с другими протеинами.

Таким образом, s100 не относятся к белкам, основная задача которых заключается в регуляции концентрации Ca 2 + . Протеины этой группы являются сигнал-преобразующими кальций-зависимыми биологически активными модуляторами, влияющими на внутриклеточные и внеклеточные процессы через связывание с белками-мишенями. В качестве последних могут выступать и нейромедиаторы, с чем связано влияние s100 на передачу нервных импульсов.

В настоящее время выявлено, что в роли регуляторов для некоторых s100 вместо Ca 2 + выступают ионы цинка и/или меди. Присоединение последних может как непосредственно влиять на активность протеина, так и изменять его сродство к кальцию.

Полноценной картины биологической роли мозгоспецифических белков s100 в организме пока не существует. Тем не менее выявлено участие протеинов этой группы в таких процессах:

  • регуляция метаболических реакций нервной ткани;
  • репликация ДНК;
  • экспрессия генетической информации;
  • пролиферация глиальных клеток;
  • защита от оксидативного (связанного с кислородом) повреждения клеток;
  • дифференцировка незрелых нейронов;
  • гибель нейронов через апоптоз;
  • динамика цитоскелета;
  • фосфорилирование и секреция;
  • передача нервного импульса;
  • регуляция клеточного цикла.

В зависимости от разновидности и места локализации мозгоспецифические протеины s100 могут оказывать как внутриклеточные, так и внеклеточные воздействия. Эффект некоторых белков зависит от концентрации. Так, широко известный белок s100B при нормальном содержании проявляет нейротрофическую активность, а при повышенном — нейротоксическую.

Внеклеточные мозгоспецифичные протеины s100 могут участвовать в воспалительных реакциях, регулировать дифференцировку глии и нейронов, а также запускать апоптоз (программируемую смерть клеток). Важность s100 была доказана в эксперименте in vitro, в котором нейроны не выживали без присутствия этого белка.

Диагностическое значение s100

Диагностическое значение s100 основано на связи его концентрации в сыворотке крови (или спинномозговой жидкости) с патологиями ЦНС и онкологическими заболеваниями. Установлено, что при повреждении глиальных клеток этот белок выходит в экстрацеллюлярное пространство, откуда поступает в спинномозговую жидкость и далее — в кровь. Таким образом, на основании повышения концентрации s100 в сыворотке можно сделать вывод о ряде патологий головного мозга. Связь между содержанием этого белка в крови и заболеваниями ЦНС была подтверждена экспериментально.

К повышению концентрации s100 во внеклеточных жидкостях приводят не только из-за разрушения клеточных преград синтезирующих этот белок клеток. Первой реакцией на многие патологии мозга является так называемый глиальный ответ, частью которого является увеличение интенсивности секреции s100 астроцитами. Увеличение содержания этого белка в крови может так же свидетельствовать о нарушении гематоэнцефалического барьера.

Контроль уровня s100 позволяет оценить степень повреждения мозга, что имеет большое значение в медицинском прогнозировании. Диагностическая связь между количеством этого протеина и нейропатологией напоминает корреляцию концентрации с-реактивного белка с системным воспалением.

Использование в качестве онкомаркера

В качестве онкомаркера белок s100 начали использовать в начале 1980-х. В настоящее время этот метод является эффективным для раннего выявления рака, рецидивов или метастаз. Наиболее часто s100 применяют в диагностике меланомы или нейробластомы.

Необходимо различать, когда анализ на этот белок проводят для определения патологий ЦНС или других болезней, а когда — для выявления рака. Если ориентировка идет именно на онкомаркер, расшифровка белка s100 должна учитывать и другие возможные причины повышения концентрации исследуемого вещества в крови. При интерпретации результатов обязательно обращают внимание на метод анализа, поскольку от него зависят границы референсного интервала (показателей нормы).

Основной недостаток маркера s100 заключается в его низкой селективности, поскольку повышение концентрации этого белка в крови и СМЖ может быть связано со многими патологиями, не обязательно раковой природы. Поэтому нельзя предавать протеину s100 определяющее диагностическое значение. Тем не менее этот белок прекрасно зарекомендовал себя в качестве сопутствующего онкологического маркера.

Уровень присутствия в сыворотке крови

В норме белок s100 должен присутствовать в сыворотке в количестве менее 0,105 мкг/л. Данное значение соответствует верхней границе концентрации у здорового человека. Превышение допустимого уровня (ДУ) s100 может свидетельствовать о:

  • ДЦП;
  • травме мозга;
  • развитии злокачественной меланомы (либо ее рецидиве);
  • наличии беременности;
  • нейробластоме;
  • дерматомиозите;
  • охватывающих большие площади ожогах.

Уровень белка также может повышаться при стрессе или длительном нахождении организма в зоне ультрафиолетового излучения. Концентрация в крови определяется соответствующим анализом.

Выявление в организме

Выявить присутствие s100 в сыворотке крови можно несколькими способами, включая:

  • иммунорадиометрический анализ (IRMA);
  • масс-спектроскопию;
  • вестерн-блот;
  • ELISA (иммуноферментный анализ);
  • электрохемилюминесценцию;
  • количественную ПЦР.

Все эти аналитические методы являются высокочувствительными и позволяют очень точно определить количественное содержание s100. Так как этот белок характеризуется коротким периодом полураспада (30 минут), высокая концентрация в сыворотке возможна только при постоянном поступлении из пораженных тканей.

В клинической диагностике чаще всего используют автоматизированный электрохемилюминесцентный иммунологический анализ на белок s100. Исследование сочетает использование антител к выявляемому протеину со световой маркировкой. Прибор определяет концентрацию s100 по интенсивности хемилюминесцентного излучения.

Антитела к белку s100

В медицине антитела к протеину s100 имеют 2 сферы практического применения:

  • диагностическую — применяют в иммунологических методах для выявления концентрации этого белка в сыворотке или СМЖ (в данном случае s100 является антигеном);
  • лечебную — введение антител в организм применяется в терапии некоторых заболеваний.

Антитела проявляют свой эффект через модулирующее воздействие на протеины s100. Известным препаратом на такой основе является «Тенотен». Антитела к s100 оказывают благоприятное воздействие на нервную систему, улучшают передачу импульса. Кроме того, такие препараты способны купировать симптоматические проявления нарушений вегетативной функции в работе пищеварительной системы.

Содержание

Белок S100 (онкомаркер S100)

Впервые белки S100 были выделены В. Moore в 1965 г. из мозга быка как нефракционированная смесь и получили свое название, из-за способности растворяться в 100% растворе сульфата аммония. Концентрация их в мозге в 100.000 раз превышает содержание в других тканях и составляет до 90% растворимой фракции белков нервных клеток.

Биохимия белка S100

Белок S100 является малым димерным протеином, т.е. состоящим из двух субъединиц, которые имеют молекулярную массу около 10,5 кДа каждая. Белок S100 имеет молекулярную массу 21кДа (10,5 кДа + 10,5 кДа), принадлежит к семейству внутриклеточных Са-связывающих белков (кальций-связывающих протеинов). Белок S100 представляет собой гомо- и гетеродимер, состоящий из двух субъединиц (β или α) в различных комбинациях: αα (S-100a), αβ (S-100 ab) и ββ (S-100b).

В настоящее время идентифицированы, по меньшей мере, 25 различных представителей этого семейства: S100A1 — S100A18, trichohylin, fillagrin, repetin, S100B, S100G, S100P, S100Z. Большинство белков S100 (до 85-90% от общего содержания в нервной ткани) сосредоточены в астроцитах; 10-15% расположены в нейронах, минимальное их количество определяется в олигодендроцитах.

Белки S100 синтезируются глиальными клетками, а затем транспортируются в нейроны. В клетке они локализуются преимущественно в цитоплазме, а также в синаптической мембране и хроматине. S100 A1 и S100 B также экспрессируются в клетках меланомы. Белки S100 обнаружены также в клетках мышечных тканей, в тканях внутренних органов (печень, почки и др.).

Функция белка S100

Различные формы белков S100 представляют наиболее универсальные из известных макромолекул, которые участвуют в регуляции практически всех основных мембранных, цитоплазматических и ядерных метаболических процессов, связанных с обеспечением механизмов восприятия и интеграции поступающей в нервную систему информации, принимают участие в ответе генов раннего реагирования, в реализации генетических программ апоптоза и антиапоптозной защиты.

Представители S100 белков демонстрируют выраженную тканеспецифичную и клеточноспецифичную экспрессию. Они вовлечены в различные процессы – сокращение, подвижность, клеточный рост и дифференциация, прогрессия клеточного цикла, транскрипция, клеточная организация мембран и динамика цитоскелета, защита от оксидативного повреждения клетки, фосфорилирование, секреция.

Показано, что S100Β проявляет нейротрофическую активность при физиологической концентрации и нейротоксическую при высокой концентрации.

Экспериментально доказано участие белков группы S100 в регуляции процессов направленного роста отростков нейронов, в завершении нейроонтогенеза как в морфологическом, так и функциональном отношении, в становлении основных форм врожденного поведения, в механизмах памяти и обучения. Многочисленные исследования доказали связь белка S100 с развитием тревожных расстройств.

Клиническое значение белка S100

Клинический интерес к белку S100 связан с применением его как маркёра повреждения мозга при следующих патологических состояниях:

  1. Травматическое поражение мозга
  2. Болезнь Альцгеймера (S100Β, высвобождающийся из некротических тканей может усиливать нейродегенерацию путём S100Β-индуцированного апоптоза)
  3. Субарахноидальные кровоизлияния
  4. Инсульт и иные неврологические расстройства
  5. Мониторинг, оценке эффективности лечения, раннее выявление рецидивов при злокачественной меланоме и других неопластических заболеваний
  6. Перинатальные гипоксические поражения ЦНС у детей
  7. Воспалительные заболевания

Белок S100 — маркер повреждения мозга

Определение уровня белка S100 может использоваться в качестве дополнительного средства к клиническим данным и результатам инструментальных исследований при ведении пациентов с возможными повреждениями головного мозга (инсульты, травмы, опухоли и др.). Концентрация S100 напрямую зависит от степени повреждения мозга и даёт значимую информацию о ведении и лечении пациентов с мозговыми нарушениями.

При травме белок S100 из повреждённых клеток мозга выделяется в системную циркуляцию и может быть определён в крови уже через несколько минут после травмы.

Уровень S100 в таких ситуациях может быть использован для исключения легких травматических повреждений мозга с высокой чувствительностью (98.8%) и специфичностью (99.7%).

Значения белка S100 ниже 0.105 мкг/л минимизируют вероятность внутричерепных повреждений и коррелируют с отрицательными результатами КТ томографии головного мозга. Повышение S100 после спонтанных субарахноидальных кровотечений коррелирует с тяжестью патологии (уровень выше 0,3 мкг/л ассоциирован с неблагоприятным течением).

Концентрация белка S100 в крови повышается после развития геморрагического или ишемического инсульта в прямой зависимости от величины очага поражения мозга. Уровень нарастания белка S100 коррелирует с тяжестью клинических симптомов при инсульте. Также наблюдение за динамикой концентрации белка S100 после инсульта даёт возможность мониторинга повторных приступов.

Таким образом, измерение белка S100 у больных с инсультом даёт точную и объективную оценку тяжести приступа и прогноза заболевания.

Белок S100 также секретируется при опухолях мозговой ткани: глиомах и нейробластомах. При диагностике опухолей мозга определение белка S100 необходимо дополнять определением маркёра NSE (нейрон-специфической энолазы).

Также белок S100 может быть использован при наблюдении пациентов с различными нарушениями кровообращения — оценка степени поражения мозговой ткани при кратковременных остановках сердца (уровень S100 в таких ситуациях должен вернуться в норму в течение 24 часов), у пациентов с нарушениями мозгового кровообращения и в случаях экстракорпорального кровообращения.

Белок S100 — маркер, ассоциированный со злокачественной меланомой

Злокачественная меланома представляет собой одно из наиболее агрессивных видов рака кожи. Опухоль развивается из меланоцитов — клеток, продуцирующих меланин (пигмент). Эти клетке продуцируют белок S100, который и используется в качестве маркера при опухолевой трансформации меланоцитов.

Для благоприятного прогноза этого заболевания критическим является раннее диагностирование первичной опухоли. Чрезвычайно важно также и раннее выявление метастазов и рецидивов заболевания.

Белок S100 является единственным чувствительным серологическим маркёром меланомы. При адекватной терапии и успешном хирургическом вмешательстве содержание данного белка снижается. У пациентов, страдающих злокачественной меланомой, особенно в стадии II, III и IV, повышение содержания S100 в крови может характеризовать прогрессирование заболевания. Это является важным фактом в мониторировании таких пациентов и прогнозировании течения заболевания.

Интерпретация результатов

Измерение концентрации S100 может значительно варьировать в зависимости от процедуры тестирования, результаты, полученные разными методами нельзя прямо сравнивать друг с другом, это может послужить причиной неверной интерпретации. При необходимости смены процедуры тестирования S100 в ходе серийного мониторинга сопоставимость результатов должна быть подтверждена параллельным измерением двумя методами.

Единицы измерения для Elecsys S100 (Roche): мкг/л. Референсные значения:

Определение в крови белка S-100, используемое для диагностики, оценки прогноза и контроля лечения некоторых онкологических, неврологических, воспалительных и других заболеваний.

Синонимы русские

  • Протеин S-100
  • Онкомаркер меланомы

Синонимы английские

Метод исследования

Единицы измерения

Мкг/л (микрограмм на литр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

  • Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Белки S-100 – это небольшие кальций-связывающие белки, относящиеся к тому же суперсемейству, что и кальмодулин, и тропонин C. В настоящий момент известно около 25 белков S-100. В организме человека они выполняют самые разнообразные функции: необходимы для роста и дифференцировки клеток, транскрипции, фосфорилирования белков, секреции, сокращения мышечного волокна и других процессов. Они регулируют клеточный цикл и апоптоз и могут поэтому участвовать в процессе онкогенеза. Концентрация белков S-100 изменяется при многих злокачественных заболеваниях, что может быть использовано для диагностики и прогноза опухолей.

Наибольшее диагностическое значение белок S-100B имеет в отношении меланомы. Белок S-100B является стандартным иммуногистохимическим маркером, который рутинно используется при патоморфологической диагностике меланомы. Также он выделяется злокачественными меланоцитами в кровь, где может быть измерен. На данный момент белок S-100B – это наиболее изученный биомаркер меланомы. Показано, что уровень белка S-100B хорошо соотносится с клинической стадией меланомы. Так, наиболее высокая концентрация этого биомаркера наблюдается при диссеминированных опухолях. Концентрация белка S-100B находится в пределах нормы у здоровых лиц и людей с доброкачественными новообразованиями кожи, но повышена в 1,3 %, 8,7 % и 73,9 % случаев меланомы на стадии I/II, III и IV соответственно. Учитывая, что на ранней стадии меланомы повышение уровня S-100B наблюдается редко, этот биомаркер не используется для скрининга меланомы. Белок S-100B также применяется для оценки прогноза меланомы: повышение уровня S-100B связано с более агрессивным течением болезни. В исследованиях доказана корреляция между уровнем белка S-100B и толщиной по Бреслоу – другим хорошо известным прогностическим фактором. Сочетание этих двух прогностических факторов позволяет получить более точную оценку прогноза заболевания. Так, повышение концентрации белка S-100B более 0,22 мкг/л в сочетании с толщиной по Бреслоу более 4 мм свидетельствует о диссеминации опухоли с чувствительностью 91 % и специфичностью 95 %. Исследование концентрации белка S-100B также используется для контроля лечения меланомы. Нарастание уровня этого биомаркера свидетельствует о прогрессировании меланомы, и наоборот, снижение его концентрации – о ее регрессе. Показано, что информативность биомаркера S-100B для оценки лечения меланомы выше, чем информативность другого биомаркера меланомы – лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Повышение белка S-100B наблюдается также при астроцитоме, опухолях почек и некоторых разновидностях лейкозов, а также при заболеваниях почек, печени (в том числе метастазах различных опухолей в печень), различных воспалительных и инфекционных заболеваниях.

Другие белки S-100 также могут иметь определенное клиническое значение при диагностике других видов рака. Так, например, белок S-100A4 может быть использован для оценки прогноза рака молочной железы, желудка, мочевого пузыря, поджелудочной железы и легкого. Белок S-100A7 является биомаркером рака легкого и яичника. Белок S-100A9 может быть использован для дифференциальной диагностики рака предстательной железы и доброкачественной гиперплазии простаты.

Возможность применения белков S-100 в клинической практике была показана не только при злокачественных заболеваниях, но и при широком спектре других патологий.

В головном мозге белок S-100B преимущественно продуцируется астроцитами, а его усиленный синтез свидетельствует об активации астроцитов в ответ на повреждение нервной ткани на фоне гипоксии или гипогликемии. Повышение уровня белка S-100B в крови и спинномозговой жидкости наблюдается при травматическом повреждении головного мозга. Показано, что определение концентрации S-100B позволяет отобрать пациентов с черепно-мозговой травмой легкой степени тяжести, действительно нуждающихся в проведении КТ, и избежать до 30 % ненужных исследований. Ученые обнаружили, что повышение уровня белка S-100B более 0,1 мкг/л является чувствительным маркером патологических изменений на КТ головного мозга. Другие примеры использования белка S-100B в неврологии:

  • повышенный уровень этого биомаркера у новорождённых свидетельствует в пользу гипоксемической/ишемической энцефалопатии при наличии асфиксии новорождённых;
  • повышенный уровень этого биомаркера (более 0,3 мкг/л) является неблагоприятным прогностическим фактором у пациентов со спонтанным субарахноидальным кровоизлиянием;
  • уровень белка S-100B повышен у пациентов с системной красной волчанкой с поражением нервной системы.

Синтез белка S-100A1 характерен для миокарда, где этот белок участвует в процессе сокращения миофибрилл. Синтез S-100A1 усилен при гипертрофии правого желудочка и снижен при тяжелой сердечной недостаточности. У пациентов с острым инфарктом миокарда отмечается повышение уровня S-100A1 в крови. Сочетание оценки по шкале Глазго менее 6 баллов, повышенного уровня нейронспецифической энолазы (NSE) более 65 нг/мл и белка S-100 более 1,5 мкг/л через 48-72 часа после сердечно-легочной реанимации при остановке сердца является высокоспецифичным индикатором неблагоприятного неврологического исхода и когнитивной дисфункции.

Белки S100A8, S100A9 и S100A2 преимущественно синтезируются фагоцитами и выполняют разнообразные функции, связанные с воспалением. Концентрация этих белков отражает активность воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, хронический бронхит и муковисцидоз.

Таким образом, белок S-100 является неспецифичным биомаркером, вследствие чего его иногда сравнивают с С-реактивным белком – другим неспецифичным, но широко используемым биомаркером заболеваний разной этиологии. Так как возможен ложноположительный результат исследования на белок S-100, во избежание диагностических ошибок рекомендуется проведение повторных анализов.

Для чего используется исследование?

  • Для диагностики, оценки прогноза и контроля лечения некоторых онкологических, неврологических, воспалительных и других заболеваний.

Когда назначается исследование?

  • В онкологии – при диагностике меланомы и некоторых других злокачественных опухолей;
  • в неврологии – при наличии черепно-мозговой травмы, асфиксии новорождённого, нейродегенеративных заболеваний (например, болезни Альцгеймера);
  • в кардиологии – при сердечной недостаточности и острой ишемии;
  • в ревматологии: при наличии ревматоидного артрита, системной красной волчанки, псориаза и других аутоиммунных заболеваний.

Что означают результаты?

Референсные значения: 0 — 0,11 мкг/л.

Причины повышения уровня S-100:

  • злокачественные новообразования (меланома, рак молочной железы, поджелудочной железы, желудка, мочевого пузыря, легкого, яичника, предстательной железы);
  • заболевания сердца (гипертрофия миокарда, острая ишемия);
  • заболевания головного мозга (черепно-мозговая травма, субарахноидальное кровоизлияние, ишемия);
  • воспалительные и аутоиммунные заболевания (ревматоидный артрит, системная красная волчанка, псориаз).

Причины понижения уровня S-100:

  • эффективное лечение заболевания;
  • сердечная недостаточность тяжелой степени тяжести (белок S-100A1).

Что может влиять на результат?

  • Стадия рака;
  • объем повреждения клеток, синтезирующих белок S-100.



Важные замечания

  • Белок S-100 является неспецифичным биомаркером.

Также рекомендуется

  • Нейронспецифическая энолаза (NSE)
  • Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) общая
  • Лабораторные маркеры рака молочной железы
  • Лабораторные маркеры рака легких
  • Лабораторные маркеры рака толстой кишки

Кто назначает исследование?

Онколог, нефролог, кардиолог, ревматолог, терапевт, врач общей практики.

Литература

  • Palmer SR, Erickson LA, Ichetovkin I, Knauer DJ, Markovic SN. Circulating serologic and molecular biomarkers in malignant melanoma. Mayo Clin Proc. 2011 Oct;86(10):981-90. Review.
  • Chen H, Xu C, Jin Q, Liu Z. S100 protein family in human cancer. Am J Cancer Res. 2014 Mar 1;4(2):89-115. eCollection 2014. Review.
  • Sedaghat F, Notopoulos A. S100 protein family and its application in clinical practice. Hippokratia. 2008;12(4):198-204.

Источники: http://fb.ru/article/422210/mozgospetsificheskiy-belok-s-chto-eto, http://www.minclinic.ru/lab/S100.html, http://helix.ru/kb/item/08-135

Оставьте комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *